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冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响(上)

基础医学论著/ 研究·

冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响

1 ,王 强1 ,姜 浩2 ,朱志华1 ,陈广琴1 ,尹 玮1 ,骆 虹1

摘要: 目的  观察冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的病理变化,进一步证实冠通方对心肌细胞的保护作用。方法 将 48 只新西兰大白兔随机分为假手术组、模型对照组、中药对照组、冠通方大剂量组、冠通方中剂量组、冠通方小剂量组,每组各 8 只。各组分别连续灌胃 14 d,制备左室心肌病理切片。比较各组病理切片在光镜下心肌细胞病理形态学结构变化,使用原位末端标记法( TUNEL 法) 测定各组凋亡细胞指数。结果 冠通方大、中剂量组心肌细胞在光镜下的结构形态得到较好的保护,冠通方大、中剂量组细胞凋亡指数较模型组显著下降( 0.05) 。结论    冠通方可以减轻心肌缺血再灌注心肌细胞的损伤,有效减少心肌缺血再灌注后心肌细胞的凋亡,从而达到保护心肌细胞的作用。

关键词: 心肌缺血再灌注损伤; 冠通方; 机制研究

中图分类号: R542.2    R285.5    文献标识码: A    doi: 10.3969 / j.issn.1672-1349.2017.13.008    文章编号: 1672-1349( 2017) 13-1569-04

心肌缺血再灌注损伤( myocardial ischemia reperfu- sion injury,MIRI) 是心脏缺血性病变再通后常见的并发症,可导致心肌细胞超微结构、功能、代谢及电生理  等方面发生进一步损伤,并可出现严重的心肌细胞内 凋亡基因的表达增高或心肌细胞凋亡。冠通方的近期 药理研究表明[1]:  使用冠通方预处理可使缺血再灌注损伤( IRI) 大鼠模型的损伤心肌组织中白细胞介素-8 ( IL-8) 表达下降,白细胞介素-10( IL-10) 表达增高,有效抑制炎症机制及坏死机制,起保护心肌的作用。本 研究通过后期动物实验观察不同剂量的冠通方干预兔  心脏再灌注损伤后心肌细胞的凋亡及病理形态改变, 进一步验证了冠通方对心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 48 只新西兰大白兔,购自广西医科大学实验动物中心[生产许可证号 SCXK( 桂) 2011-0003],体质量 2.5 kg ~ 3 kg,适应性饲养 1 周后开始分组。

1.2 实验药wu 冠通方组成: 田七 45  g,生晒参 100 g,丹参 150 g,地龙 150 g,全瓜蒌 150 g,绞股蓝 150 g,麦冬 150  g,陈皮 100  g。由广西中医药大学制药厂按上述配方制成颗粒剂( 每包含生药 4 g) ,分装规格为每包 3.5 g。复方丹参滴丸( 每粒 27  mg) ,由天津天士力制药股份有限澳门尼维斯网站大全生产( 国药准字 Z10950111,生产批号 101210) 。

1.3 实验试剂及仪器 TUNEL 检测细胞凋亡试剂盒为德国 Roche 澳门尼维斯网站大全生产,-20 ℃ 保存,使用前置于 4 ℃溶解混合; DAB 显色液试剂盒为北京中杉金桥生物有限澳门尼维斯网站大全生产,4 ℃ 保存,使用前置于室温与稀释液以 1∶ 25 稀释混合,现配现用; 蛋白酶 K 溶液为北京中杉金桥生物有限澳门尼维斯网站大全生产,-20 ℃ 保存,使用前置于 4 ℃以 1 ∶ 25 稀释,现配现用; 磷酸盐缓冲液( PBS) 为北京中杉金桥生物有限澳门尼维斯网站大全生产,粉剂- 4 ℃ 保存,使用前置于37 ℃ 与蒸馏水0 . 01 mol / L 稀释,pH 为7 . 2 ~ 7.4,现配现用; 其余甲醛、酒精、二甲苯等均为国药集团化学试剂有限澳门尼维斯网站大全生产,室温避光密封保存。全自动脱水机( 德国 Leica,ASP300S) ,石蜡切片机( 德国 Leica,RM2245) ,奥林巴斯显微镜( 日本  OLYMPUS, BX53) ,病理图文摄像头( 日本OLYMPUS,DP73) ,小动物呼吸机( 北京智鼠多宝生物科技有限澳门尼维斯网站大全,DW-3000) 。

       1.4 方法

1.4.1 分组及给药 将 48 只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为 6 组,分别为假手术组、模型对照组、中药对照组[复方丹参滴丸 54 mg / ( kg·d) ]、冠通方大剂量组[3.6 g / ( kg·d) ]、冠通方中剂量组[1.8 g / ( kg·d) ]、冠通方小剂量组[0.9 g / ( kg·d) ],每组 8 只。用药剂量根据人兔临床用药剂量换算公式[2]换算成兔用药量。实验动物行分笼饲养,于每天早上灌胃给药,假手术组和模型对照组予蒸馏水灌胃。各组均连续灌胃14 d,于末次给药 1 h 后进行标本采集。

1.4.2 2 模型建立 经耳缘静脉注射戊ba比妥钠 30 mg / kg 麻醉后,背位固定,四肢皮下连接心电图电极,记录标准  Ⅱ导联心电图。颈部正中切开皮肤,钝性分离颈前肌, 切开气管,插入 Y 型气管插管,连接微型人工 呼吸机( 潮气量1 0 mL / kg ~ 1 5 mL / kg ,频 率4 0次/ min) 。沿胸骨左缘 3 ~ 4 肋间隙开胸,暴露心脏。采用 5 ~ 0 线结扎冠状动脉左前降支(  LAD)  法制备心肌缺血再灌注模型,为避免实验动物心肌梗死面积过大导致死亡, 冠状动脉阻断点应在冠状动脉左前降支向下 5 mm ~ 10 mm 处选择结扎位点,以心电图出现 ST段弓背抬高和结扎线以下心肌组织颜色变暗、局部节段性运动bu良为结扎成功。待结扎 40 min 后剪断手术线实现再灌注,灌注时间为 2 h。以缺血区转红并反应性充血、收缩活动逐渐恢复、ST 段恢复 1 /2 以上为再灌注成功。假手术组只穿线不结扎,余操作同上。

标本采集及指标检测IRI 心肌组织 HE 染色病理切片 造模实验结束后,处死兔子,剪下心脏,造模实验结束后,处死兔子,剪下心脏,取左心室心肌( 包括缺血边缘区、心肌缺血区、冠状动脉结扎区心肌组织) 。将标本置于 10% 中性甲醛液中固定,经全自动脱水机脱水 14 h,常规石蜡包埋,石蜡切片厚 4 μm,常规脱蜡至水,进行 HE 染色、封片,镜下观察心肌组织基本病理改变。

1.4.2.1 TUNEL 法染色 参考罗氏 TUNEL 检测细胞凋亡试剂盒说明书进行,用 0.3%过氧化氢溶液封闭 30 min; 20 mg / L 蛋白酶 K 消化膜蛋白及核蛋白; 加入TUNEL 反应液,37  ℃ 孵育 60  min; 加入 FITC 标记抗体,DAB 显色,苏木素复染,脱水透明,封片。

1.4.2.2 心肌细胞凋亡指数测量   在光镜下观察心肌细胞凋亡情况,电镜下呈棕色颗粒者为染色阳性的凋亡心肌细胞。心肌细胞凋亡指数观察:  每只兔子观察4 张切片,每张切片在高倍镜下( 400 ×) 随机观察 5 个不同视野,每个视野计算凋亡细胞个数和所有细胞个数,以凋亡阳性细胞数/ 总细胞数的百分比为心肌细胞凋亡指数,取平均值。

1.5 统计学处理    本研究采用 SPSS Statistics 19.0 进行实验数据统计,用单因素方差分析,计量资料以均数 标准差( ± ) 表示,组间比较用检验,以

0.05 为差异有统计学意义。