澳门尼维斯人网站

产品搜索
 

澳门尼维斯娱乐
联系人:孟先生
联系电话:010-61210147
传真号码:010-83551731
移动电话:15313005355   18612351088
澳门尼维斯网站大全地址:北京市大兴区黄村东大街38号院3号楼11层1112室火神庙商业中心D座1112室
Email:zhishuduobao@126.com
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4

颅骨钻-头穴透刺对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经生长因子表达的影响

头穴透刺对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经生长因子表达的影响

牛彦彦 鲍春龄 岳亚琳 石程

摘要  目的 观察头穴透刺法对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经生长因子( NGF) 表达的影响方法健康雄性 Wistar 大鼠120 只按照随机数字表法分为假手术组模型组针刺组每组 40 只每组再随机分为6 h24 h3 d7 d 4 个时点采用改良的自体动脉血法制备大鼠脑出血模型给予“百会”透“太阳”穴电针干预通过 Longa 评分法进行神经行为学评估**组织化学法检测血肿周围脑组织 NGF 的阳性细胞表达q- PC 法检测 NGF mNA 表达量结果与假手术组比较模型组各时点神经行为学评分升高NGF 阳性细胞数增多NGF mNA 表达上调差异有统计学意义(P  0. 05) ; 与模型组比较针刺组 6  h 神经行为学评分 NGF 的阳性细胞数NGF mNA 表达均无明显变化差异无统计学意义(P  0. 05) 针刺组24 h3 d7 d 神经行为学评分降低NGF 阳性细胞数增多NGF  mNA 表达上调差异有统计学意义  (P  0. 05) 结论   “百会”透“太阳”头穴透刺通过上   NGF   基因及蛋白的表达促进脑出血大鼠神经功能恢复具有良好的神经保护作用

关键词 头穴透刺; 脑出血; 神经保护; 神经生长因子

脑出血( intracerebral  hemorrhage,ICH) 后血肿造成脑实质损害,血肿边缘的半暗带区发生一系列的病理生理过程,脑组织血液供应障碍,缺血缺氧,导致水肿半暗带的细胞死亡,从而出现脑功能障碍。积极有效地保护脑出血后神经元的损伤,挽救脑出血半暗带,恢复其神经功能,仍然是目前神经科学研究的重点和难点。神经生长因子( never  growth  factor,NGF) 具有维持交感神经和感觉神经细胞存在,促进神经细胞分化,决定轴突生长方向,促进损伤的**神经修复,维持生存及诱导突起生长的作用,对**神经损伤起到重要的神经保护作用[1]。近年来人们对 NGF 结构与神经损伤相关部位的功效有了广泛深入地研究和认识。如 NGF 的信号传递路径[2]、NGF 在炎症疼痛及修复过程中的作用[3]、NGF 的基因表达影响因子[4]、NGF 及受体在肿瘤的形成和肿瘤疼痛中的角色 [5]及结合神经生长因子各种载体的基因表达[6]等方面都开展了研究。随着对 NGF 功能的了解,对该类**及 NGF 拮抗剂**[7]用于**某些慢性**或者疼痛也进行了很多试验和探索,但针灸对ICH 后脑组织NGF 影响的报道尚不多见[8]。而头针透刺**脑出血的有效性,已经在临床实践中得到广泛的证实[9]。本研究通过“百会”透“太阳”头穴透刺法观察其对脑出血大鼠血肿周围脑组织 NGF 表达的影响,现报道如下。

材料与方法

动物及分组 健康雄性 Wistar 大鼠 120 只,清洁级,体重( 300 ± 20)   g,由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心提供,实验动物生产许可证号: SCXK( 沪) 2012 - 0002,实验动物使用许可证号: SYXK( 沪) 2013 - 0109。室温 22 ~ 25 ℃ ,相对湿度45% ~ 65% ,适应性饲养 1 周。按随机数字表法分为3 组,每组 40 只,每组又随机分 6 h、24 h、3 d、7 d 4 个时点,每个时点 10 只动物,5 只用于**组化检测,5只用于 q-PCR 检测。

主要试剂及仪器     脑立体定位仪 SR-6N 型 ( 日本Stoelting 澳门尼维斯网站大全) ,电动颅骨钻 DB014( 澳门尼维斯娱乐) ,100  μL 微量进样器( 上海高鸽工贸有限澳门尼维斯网站大全) ,德国莱卡 2135 型切片机,美国Moticam3000 显微摄影成像系统,华佗牌针灸针( 苏州医疗用品厂有限公) ,电针**仪: G6805-Ⅱ型( 上海华谊医用仪器有限澳门尼维斯网站大全) ,超细匀浆器 F6 /10 - 6G ( Fluko 上海流体机械制造有限澳门尼维斯网站大全,q-PCR 仪 ViiA7( life technology ABI ) ,Anti-NGF antibody ( ABCam,ab6199) ,K5007 型组化试剂盒、DAB 显色剂( DAKO 澳门尼维斯网站大全) 、BioTNT 逆转录试剂盒等

1 方法

3. 1 ICH 模型制作 参照任泽光的方法10]复制脑出血模型并进行改良调整立体定向仪使门齿钩平面比耳间线平面低 2. 4  mm头颅背侧剪去鼠毛75%酒精**后于正中切开约 10  mm 纵行切口30% 的双氧水剥蚀骨膜暴露前囟点 bregma于 bregma 点正中中线右侧旁开 3. 5 mm 向后 0. 2 mm 处用微型打磨电钻钻一直径约 1 mm 的小孔注意不伤及硬脑膜将微量进样器固定于此用微量进样器进针抽取 100 μL 自体股动脉血液向脑内注射深度为 6. 0  mm匀速注射自体动脉血10 min 内注射完毕后留针10 min移出针头骨蜡封闭针孔碘伏**缝合头皮术后标 鼠笼分笼饲养给予 12 h 光照 12 h 黑暗循环饲养温度 20  25 ℃ 相对湿度 40%  65% 自由进水及食物

3. 2   分组处理方法    按随机数字表法分为假手术组: 向大鼠脑内尾状核中心部注入 100 μL 0. 9% 的生理盐水模型组: 向大鼠脑内尾状核中心部注入100 μL 自体股动脉血不做干预针刺组: 大鼠造模成功后 1  h给予“百会”透“太阳”穴电针干预百会在大鼠头顶两耳根连线与前后中线交点( 相当于人体百会处) ,太阳在外眼角与耳之间的凹陷中( 相当于人体太阳穴)   ,参照大鼠穴位图谱的研制11]常规**以0. 25  mm × 30  mm 毫针两根分别刺入百会( 向右前太阳穴方向) 和右侧太阳穴 G-6805Ⅱ型电针仪正极接百会穴毫针负极接太阳穴毫针连续波频率2 Hz, 电流强度 1  mA留针 30  min从造模成功后 1  h开始进行针灸**1 次/ d直至相应时点取材

3. 3 观察项目及检测方法

3. 3. 1   神经行为学评分    大鼠苏醒后参照 Longa 法12]评分0  分: 未见神经病学征象无神经功能缺损症状; 1 分: 大鼠被提尾倒悬时病灶右侧前肢呈屈曲抬高状态不能伸展右侧前爪; 2 分: 有向瘫痪侧旋转的征象即行走右侧转圈; 3  分: 有向病灶对侧跌倒的征象即行走困难并向右侧倾倒; 4  分: 不能自发行走意识水平呈下降状态达到 1 3 分为造模成功 采用差额补充的方法以保证每组的实验动物例数

3. 3. 2 NGF 阳性细胞数 造模完成后相应的时间点将大鼠处死取材先将 0. 9% 的生理盐水和 4% 的多聚甲醛固定液 4 ℃ 预冷10% 的水合氯醛( 0. 4 mL /100 g) 腹腔注射麻醉打开横膈迅速开胸暴露心脏立刻将输液针头由左心室插入主动脉剪开右心耳 生理盐水快速灌注约 250 mL 后大鼠肝脏由暗红转为浅黄右心耳缺口处流出液体己澄清换成 4% 多聚甲醛继续灌注先快速灌注 100  mL剩余 150  mL 缓慢滴注可观察到大鼠四肢剧烈抽搐全身多处明显的肌肉颤 约30  min 后大鼠颈部四肢及尾部僵硬断头暴露颅骨取出大脑用锋利的刀片于冠状位取针道前 1. 5 2 mm 之间的脑组织连同包埋架一起投入4% 多聚甲醛内于 4  ℃ 固定约 24  h石蜡包埋制成厚 4 μm 的切片进行**组化染色

Moticam3000 显微摄影系统于 400 倍下摄片采用Image-pro plus6. 0 病理图像分析系统对阳性表达细胞数进行分析DAB 显色阳性细胞呈棕黄色或褐色张切片随机观察并计数脑出血区血肿周边 5 个不重复视野计算阳性细胞总数

3. 3. 3 NGF mRNA 表达量 组织样品按 50  100  mg / mLTrizol 加入 Trizol用电动匀浆器充分匀浆约 2 min; 组织匀浆或细胞破碎后室温放置5  min使其充分裂解; 12  000  r / min  离心 5  min弃沉淀; 200 μL 氯仿/ mLTrizol 加入氯仿振荡混匀后室温放置 15 min;  4  ℃ 12 000 g  离心 15 min;  吸取上层水相至另一离心管中; 0. 5 mL 异丙醇/ mL Trizol 加入异丙醇混匀室温放置 10 min; 4℃  12  000 g  离心 10  min弃上清NA  沉于管底; 1 mL 75 % 乙醇/ mL Trizol 加入 75 % 乙醇温和振荡离心管悬浮沉淀; 4  ℃  8  000 g  离心 5  min尽量弃上清; 室温晾干或真空干燥 10 min; 50 μL H2 O溶解 NA 样品55   60  ℃  5   10  min取去除核酸酶的无菌 EP 管放置冰上; 分别加入 Oligo ( dT)   1  μL模板 NA  2  μL去核酸酶的水  9  μL; 70  ℃ 加热 5  min立即将微量离心管插入冰浴中至少 1  min; 再分别加入 Buffer 5  μLdNTP  1. 25  μLNA 酶抑制剂 0. 375  μL逆转录酶 1  μL补足水至总体积 25 μL; 42 ℃ 反应持续 60 min 终止反应; 所得产物即 cDNA, 80 ℃ 保存设置内参 GAPDH 引物: 上游引物序列 5 ' -GTG CCA GCC TCG TCT CAT A-3 ' 游引物序列 5 ' -GAA  CTT GCC GTGGGT AGA G-3 ' ; 引物长度: 187 bp NGF 上游引物5 ' -AGT GTG TGG GTT GGA GAT A-3 ' 下游引物: 5'- AAA GGT  GTG  AGT  CGT  GGT  G-3'引物长度: 204  bp设置PC 反应体系: 2 × 荧光染料混合物 5  μL上游引物 1 μL下游引物1 μLcDNA 模板0. 5 μL去 NA 酶水定容至 10 μLPC 扩增反应条件为预变性 95 ℃ 10 min变性 95 ℃15 s退火延伸 60 ℃  30 s经 40 个循环; PC 溶解反应条件为 95  ℃ 15  s,60   ℃  30  s( 0. 3 ℃ / s) 95 ℃  15  s通过 2 △Ct*终算得样品 m-NA 的相对含量

3. 4 统计学方法 采用 SPSS 20. 0 软件进行统计计量数据采用x ±s  表示3 组比较采用单因素方差分析组间两两比较采用q  检验P  0. 05为差异有统计学意义

各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较  ( 1)   假手术组大鼠未见明显的神经功能变化造模成功后模型组大鼠出现病灶对侧上下肢瘫痪表现为肢体活动减少或肢体无力多数大鼠不能直行站立不稳呈“划圈样”步态; 术后 6 h 模型组出现神经缺损症状24  h 模型组神经缺损*为严重3  d 时逐渐减轻 7 d 时神经缺损症状又进一步减轻但行为学评分仍在 2 分以上针刺组在 24 h  37 d 时均较模型组行为学评分减少差异均有统计学意义(P  0. 05) 。

各组大鼠不同时点血肿周围脑组织 NGF 阳性细胞数比较( 表 2图 1)     假手术组可见少量 NGF 阳性细胞表达且在各时点无明显变化模型组 NGF 在血肿周围开始出现表达增加24  h3  d 时 NGF 阳性细胞数继续增加7  d 时达*高从阳性细胞的形态来看大部分为神经元细胞胞体较大形态较规则** 阳性颗粒位于胞体和突起呈均匀的棕黄色颗粒小部分是小胶质细胞呈圆形或椭圆形形态不规则阳性颗粒位于细胞胞质与假手术组比较模型组各时 NGF 阳性细胞数增多差异均有统计学意义(P  0. 05) ; 与模型组比较针刺组 24 h  37 d 时NGF 阳性细胞数均增多差异亦有统计学意义(P  0. 05) 。

各组大鼠不同时点血肿周围脑组织 NGF  m- NA 表达量比较( 3) GAPDH 作为内参脑出血后 624  h 及 37  d假手术组大鼠 NGF  mNA 表达量未见明显变化; 脑出血后 6  h模型组 NGF mNA  表达量开始升高24  h 达*高后开始降低至 7  d 时*低与假手术组比较模型组各时点 NGF mRNA 表达均上调差异有统计学意义(P  0. 05) ; 针刺组 24 h 及37  d 时NGF  mNA 表达量均上调差异有统计学意义(P  0. 05) 。